Με τον Αριστοφάνη τον Βυζάντιο επιβεβαιώνεται η παράδοση, σύμφωνα με την οποία ο προϊστάμενος της Αλεξανδρινής Βιβλιοθήκης είναι όχι μόνον παιδαγωγός της βασιλικής οικογενείας αλλά και μαθητής του προκατόχου του.
Γεννήθηκε στο Βυζάντιο μεταξύ 258 και 255 π.Χ. και ανέλαβε τα καθήκοντά του στη Βιβλιοθήκη μετά τον θάνατο του Ερατοσθένη, μεταξύ του 196 και του 193 π.Χ., όταν στον θρόνο της Αιγύπτου ήταν ο Πτολεμαίος Ε΄ ο Επιφανής (204–180 π.Χ.). Δεν έχουμε πληροφορίες για τη συμβολή του στην εξέλιξη της Βιβλιοθήκης, αλλά εικάζουμε από τις σχετικές φιλολογικές του δραστηριότητες: γνωρίζουμε δηλαδή ότι προς το τέλος της ζωής του (περ. 180 π.Χ.) ολοκλήρωσε την κριτική αναθεώρηση των κειμένων της επικής, της λυρικής και της δραματικής ποίησης.
Μνημονεύονται στη Σούδα και από τον Πλίνιο τον Πρεσβύτερο (Φυσ. Ιστορ., 7, 13) δύο περιστατικά από τον βίο του, ενδεικτικά για το κλίμα που επικρατούσε στον χώρο του Μουσείου της Αλεξάνδρειας. Το πρώτο αναφέρεται στην πρόσκληση που απηύθυνε ο βασιλιάς της Περγάμου Ευμένης Β΄ (λίγο μετά το 197 π.Χ.) στον Αριστοφάνη, για να αναλάβει την οργάνωση της νέας βιβλιοθήκης του. Όταν αποκαλύφθηκε το σχέδιο απόδρασής του από το Μουσείο, συνελήφθη και κλείστηκε στη φυλακή. Το δεύτερο περιστατικό θυμίζει περισσότερο τραγελαφικό ανέκδοτο: Λέγεται ότι ο Αριστοφάνης υπήρξε «αντεραστής» μ’ έναν ελέφαντα, επειδή αγάπησαν μία ανθοπώλιδα της Αλεξάνδρειας. Όσο κι αν ακούγεται παράλογη η ιστορία αυτή, στην Αλεξάνδρεια κυκλοφορούσαν πολλές ανάλογες διηγήσεις για ελέφαντες, τους οποίους φαίνεται ότι προσείλκυαν τα αρώματα από τα λουλούδια, τα οποία έπλεκαν σε στεφάνια οι κόρες για να τα πουλήσουν (Αιλιανός, Περί ζώων).
Ο Αριστοφάνης έτρεφε απεριόριστο θαυμασμό για το έργο του Μένανδρου, τον οποίο τοποθετούσε μετά τον Όμηρο. Η εκτίμηση αυτή ωστόσο, δεν τον εμπόδισε να κρίνει τις κωμωδίες του, συντάσσοντας έναν κατάλογο με χωρία από θεατρικά έργα του Μένανδρου, τα οποία ήσαν δάνεια από γραπτά άλλων. Ο κατάλογος αυτός αποτελεί ένα από τα αρχαιότερα πονήματα που αναφέρονται στη λογοκλοπή.
Μία άλλη σημαντική συμβολή του Αριστοφάνη, που αφορά στη βιβλιοθηκονομική ταξινόμηση του υλικού της Βιβλιοθήκης, ήταν η σύνταξη ενός Καταλόγου: Προς τους Καλλιμάχου Πίνακας. Το έργο αυτό αποτελούσε, πιθανότατα, συμπλήρωμα στους Πίνακες του Καλλίμαχου. Ωστόσο, ο Αριστοφάνης, βελτίωσε κατά την άποψή του και άλλες πλευρές του έργου του Καλλίμαχου: λόγου χάρη κατέταξε τους Πλατωνικούς Διαλόγους, σε τριλογίες (Διογένης Λαέρτιος, 3, 61–62).
Κ.Σπ. Στάικος, Η Ιστορία της Βιβλιοθήκης στον Δυτικό Πολιτισμό, τόμ. Ι, Αθήνα, Κότινος, 2002, σ. 180–182.